چهارشنبه 1 آذر 1396 - 03 ربيع الأول 1439
 منو
 
  راهنمای تولید آنتی بادی های پلی کلونال و مونوکلونال

ضمیمه 4

راهنمای تولید آنتی بادی های پلی کلونال و مونوکلونال در جوندگان و خرگوش

دانشگاه علوم پزشکی تبریز

کمیته سازمانی اخلاق با محوریت مطالعات حیوانی و آزمایشگاهی

 

اینجانب، راهنمای تولید آنتی بادی های پلی کلونال و مونوکلونال (ضمیمه 9) در جوندگان و خرگوش را مطالعه نموده و مطلع هستم که استفاده از اجوان کامل فروند تحت شرایط خاصی مجاز بوده و در غیر اینصورت باید از جایگزین های آن استفاده شود. همچنین اطلاع دارم که تزریقات داخل جلدی یا داخل کف پا، مستلزم توجیهات ویژه و تایید توسط کمیته استفاده از حیوانات به روش اخلاقی می باشد.

هر گونه تخطی از این راهنما مستلزم توجیه مناسب و تایید قبلی کمیته سازمانی اخلاق با محوریت مطالعات حیوانی و آزمایشگاهی می باشد.

 

اینجانب ...................................... از راهنمای مذکور تبعیت می نمایم.

 

                                                               یا

 

اینجانب ...................................... توجیهات کتبی برای عدم تبعیت از این راهنما را تهیه نموده ام.

 

 

امضای محقق اصلی                                                       تاریخ

 

 

لطفاً ارجاع شود به کمیته سازمانی اخلاق با محوریت مطالعات حیوانی و آزمایشگاهی

 

 

ضمیمه 9

راهنمای تولید آنتی بادی های پلی کلونال و مونوکلونال

 

پیشگفتار:

 

کمیته سازمانی اخلاق با محوریت پژوهش های حیوانی به منظور کمک به نحوه ارزیابی اخلاقی پروژه هایی که شامل تولید آنتی بادیهای مونوکلونال وپلی کلونال هستند، اقدام به تهیه "راهنمای اخلاقی تولید آنتی            بادی های مونوکلونال" نموده است.

 

این راهنما بر  اساس ملاحظات ذیل تدوین گردیده است :

 

  • تولید آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال با استفاده ازحیوانات حاوی روشهایی است که با استفاده از آنها امکان ایجاد درد و پریشانی در حیوان قابل توجه است.

 

  • روشهایی که می توانند درمطالعات علمی و یا فعالیت های آموزشی جایگزین استفاده از حیوانات شوند و یا در مواردی این مطالعات را تکمیل کنند، باید در اولویت قرار گیرند و در صورت امکان بکار گرفته شوند.

 

  • در حال حاضر روشهایin vitro  وجود دارد که می توانند در بسیاری از مطالعات بدون آسیب رساندن به اهداف تحقیق جایگزین روش مایع صفاقی شوند. این روشها قابل دسترسی هستند و بهتر و یا حداقل یکسان با روش مایع صفاقی در کیفیت آنتی بادی تولید شده هستند.

 

تولید آنتی بادی های مونوکلونال شامل سه مرحله می باشد:

 

·         مرحله ایمونیزاسیون که شامل القای سلول های تولید کننده آنتی بادی بصورتin vivo  می باشد.

 

·         آزمایش و انتخاب سلول های تولید کننده آنتی بادی که بصورت in vitro می باشد.

 

·         تکثیر سلول های انتخابی بصورت in vitro یاin vivo  برای تولید آنتی بادی های مونوکلونال. سلول ها بصورت in vitro در بیو رآکتور تکثیر می یابند. در نوع in vivo سلول ها در موش تکثیر می یابند تا مایع صفاقی حاوی آنتی بادی های مونوکلونال تولید شود.

 

توصیه این کمیته عدم استفاده از روش مایع صفاقی است، مگر در موارد نادری که استفاده از روش های in vitro مناسب به نظر نمی رسند.

 

در مورد تولید آنتی بادی های پلی کلونال تمامی اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی و ایمونیزاسیون و موارد مشترک با اصول اخلاقی تولید آنتی بادی مونوکلونال به شرح فوق باید رعایت گردد.

 

مقدمه:

       این راهنما برای موارد ذیل قابل اجرا می باشد: 

  • محققین و موسساتی که آنتی بادی های مونوکلونال را برای اهداف علمی، آموزشی و یا تجاری تولید می کنند و یا بر تولید آنها نظارت می نمایند.
  • تمامی پروپوزال های تحقیقاتی جدید یا ثبت شده:

o               پروپوزال هایی که قبل از این راهنمای اخلاقی تصویب شده اند می توانند با همان روش قبلی به کار خود ادامه دهند. ولی اگردر پروپوزال تحقیقاتی تغییراتی مبنی بر تولید آنتی بادیهای مونوکلونال ایجاد شد که قبلا در طرح پیشنهادی وجود نداشت، باید از این راهنما تبعیت گردد.

o               این راهنما منبع اطلاعاتی در رابطه با نحوه تولید آنتی بادی های مونوکلونال نیست. در ضمن به آنتی بادی های مونوکلونالی که بعنوان معرف از بازارهای تجاری قابل تهیه هستند تعمیم داده نمی شود. با اینکه توصیه می شود در هنگام خرید این محصولات، از شرکت هایی خرید گردد که اصول اخلاقی را در تولید آنتی بادی ها رعایت می کنند.

 

 اصول اخلاقی کار با حیوانات

o               سه هدف اصلی در این دستورالعمل مد نظر قرار دارد:

o               جایگزینی استفاده از حیوانات با سایر روش ها

o               انجام کار با کمترین تعداد حیوان مورد نیاز

o               تکنیک های اصلاح شده برای کاهش درد و رنج حیوانات در تحقیقات

اصول کلی اخلاقی در پژوهش های حیوانی طبق دستورالعمل مراقبت و استفاده ازحیوانات آزمایشگاهی رعایت گردد. وظایف محققین و موسسه کاملا مشخص گردد.

در پروپوزال ارائه شده باید دلایل کافی برای ضرورت استفاده از حیوان در تحقیق ذکر شود و مهمتر از آن، باید دلایل قانع کننده ای برای رد کردن تکنیک هایی که مستقل از حیوان هستند ارائه شود. در ادامه کمیته باید اطمینان حاصل کند که هیچ روش جایگزینی برای تولید MAb مورد نظر وجود ندارد و حتما باید از روش های In vivo   استفاده شود.

در کار با حیوان باید همه مواد و لوازم مصرفی پیش بینی شده تهیه گردد و افراد مشخص شده در پروپوزال مهارت لازم برای کار با حیوانات را داشته باشند. همچنین کمیته باید مطمئن شود که همه حیوانات طبق قوانین ذکر شده نگهداری  می شوند و طی انجام کار، اصول اخلاقی مربوط به کار با حیوانات رعایت می شود.

در صورت لزوم استفاده از روش In vivo ، باید توضیحات کامل در مورد روش های آزمایش، جراحی و پروسه های مرتبط مانند دوز و ... ارائه شود.

 

 جایگزینی

 استفاده از روش مایع صفاقی :

تولید MAb در شرایط In vitro یک روش پذیرفته شده است. اگر برای تولید آنتی بادی اختصاصی روش های        In vitro مناسب وجود نداشته باشد می توان از روش مایع صفاقی برای رسیدن به این هدف استفاده کرد. برای این منظور، هیبریدوما توسط داوران متخصص تولید آنتی بادی مونوکلونال بررسی می شود و تصمیم نهایی در مورد روش انتخابی توسط کمیته اتخاذ می شود.

 نقش کمیته در بررسی درخواست های تولید MAb

1-  کمیته باید بر اساس نظرات داوری علمی تشخیص دهد که تمامی هیبریدوماها اختصاصی هستند. به این ترتیب معمولا به ندرت متد مایع صفاقی برای تولید MAb تنها روش قابل استفاده خواهد بود. درحالت کلی این روش را نمی توان برای تولید آنتی بادی ها به کار برد و فقط برای تولید آنتی بادی هایی که با روش های             In vitro تولید نمی گردند، به کار برده می شود.

2 - کمیته نباید تنها به دلیل افزایش هزینه های طرح در روش In vitro با روش مایع صفاقی موافقت نماید. اما اگر ضرورت انجام طرح بر کمیته اثبات گردد ولی هزینه های طرح به روش In vitro قابل تامین نباشد، کمیته می تواند رای به انجام روش In vivo با هزینه کمتر بدهد.

 

نکاتی در مورد تولید آنتی بادی مونوکلونال در شرایط In vitro :

روش های زیادی برای به حداکثر رساندن محصولات آنتی بادی مورد نظر در شرایط In vitro وجود دارد. تنوع محیط های کشت جدید، که به دلیل داشتن ویژگی های منحصر به فرد و گوناگون باعث شکل گیری کلون های منحصر به فرد می شوند، یکی از مهمترین این حالت ها است. به یاد داشته باشیم که در این روش باید سل لاین ها از نظر تولید یک کلون ثابت و همچنین تولید آنتی بادی مورد نظر توسط همه سلول های موجود با استفاده از تکنیک های وسترن بلات، الایزا و رنگ آمیزی ایمنی  مورد بررسی قرار گیرند.

 

بهینه سازی

بهینه سازی ایمونیزاسیون (القای سلولهای لنفوئیدی تولید کننده آنتی بادی) :

 محل تزریق : بهترین روش تزریق آنتی ژن در موش، تزریق زیرجلدی یا داخل صفاقی است. برای آنتی ژن های محلول بدون ادجوانت بهترین روش، تزریق داخل رگی است.در مورد آنتی ژن هایی که به همراه ادجوانت هستند باید از راه عضلانی یا جلدی تزریق شوند.  برای جلوگیری ازعوارض ناخواسته باید موش ها هر چند ساعت یک بار بررسی شوند.

·         استفاده از ادجوانت :

همه ادجوانت ها محرک هستند، بنا براین برای جلوگیری از عوارض ناخواسته این مواد، باید موش ها مرتب بررسی شوند. ادجوانت فروند نباید بیش تر از 100 میکروگرم به ازای هر تزریق مورد استفاده قرار بگیرد. ادجوانت کامل فروند را نباید بیش از یکباراستفاده کرد. اگر ادجوانت فروند از محل مناسبی تزریق نشود گرانولوما یا آبسه در محل تزریق ایجاد       می شود. ترکیب آنتی ژن و ادجوانت نباید بیش تر از 200 میکرولیتر(در خصوص موش) باشد.

·         حذف آلودگی هیبریدهای آلوده :

اگر سل لاین توسط قارچ یا باکتری آلوده شده باشد، می توان سلول های هیبریدومایی را به صورت زیر جلدی یا داخل شکمی به موش سالم تزریق کرد و  سپس سلول های پاک شده را از صفاق خارج و به محیط کشت مناسب انتقال داد. البته این کار فقط در صورتی انجام می گیرد که امکان تهیه مجدد سل لاین مورد نظر وجود نداشته باشد.

 

 

بهینه سازی تولید در روش مایع صفاقی (تکثیرin vivo کلون های هیبریدوما وجمع آوری مایع صفاقی)

در موارد بسیار نادری که روش مایع صفاقی مورد تایید برای استفاده قرار می گیرد، محقق باید مدارک کافی مبنی بر تلاش برای استفاده از روشهای in vitro و شکست آنها را به کمیته ارائه دهد. مهمترین مطلب در استفاده از این روش مهارت عملی و علمی  افراد در کار با موش و تشخیص علایم درد و ناراحتی )آزار) موش است.

  • حتی الامکان از کمترین دوز ممکن ماده اولیه لازم برای رسیدن به نتیجه مطلوب استفاده شود. در واقع این مقدار نباید بیش از 200 میکرولیتر باشد.
  • در جمع آوری مایع صفاقی جهت جلوگیری از ایجاد درد و آزار و ناراحتی، حیوانات تحت پایش مداوم باشند. اگر برداشت مایع بیش از حد مجاز باشد می تواند باعث آزار حیوان شود. تنها در صورتی می توان مایع صفاقی را برداشت کرد که قبلا حیوان با توجه به اصول اخلاقی رفتار با حیوانات کشته شده باشد.
  • مدت زمان نگهداری موش بعد از تزریق هیبریدوما- موش ها نباید بیش از 28 روز پس از تزریق هیبریدوما نگهداری شوند و این درحالی است که جمع آوری مقدار مناسبی از مایع صفاقی حدود 14 روز طول می کشد. در این حین اگر در حیوان درد یا آزار مشاهده شد،  باید مطابق با اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رفتار شود .  
  •  

امضای محقق اصلی                تاریخ

فایل pdf  ضمیمه شماره 4 و 9 (راهنمای تولید آنتی بادی های پلی کلونال و مونوکلونال در جوندگان و خرگوش)

فایل word ضمیمه شماره 4 و 9 (راهنمای تولید آنتی بادی های پلی کلونال و مونوکلونال در جوندگان و خرگوش)

نوشته شده در   يکشنبه نهم خرداد 1395  توسط   فاطمه ذابح جمشیدی
ویرایش شده توسط فاطمه ذابح جمشیدی